En 1997, Rebecca Romijn fait ses débuts d'actrice dans un épisode de la série télévisée Friends, puis apparaît en invité star dans le feuilleton La Fête à la maison où joue également John Stamos, qu'elle épouse en 1998. Au cinéma, elle figure aux génériques des comédies Dirty work (1998) de Bob Saget, Austin Powers 2 : L'Espion qui m'a tirée (1999) de Jay Roach et The Intern (2000) de Michael Lange.
En 2000, elle décroche un rôle de plus grande importance grâce à X-Men de Bryan Singer. Dans cette adaptation cinématographique du célèbre comic book, elle interprète Mystique, une captivante et maléfique "métamorphe", capable de se transformer en toute personne ou objet de son choix. Rebecca Romijn tourne également sous la direction de grands réalisateurs : John McTiernan pour les besoins de Rollerball (2002, ce qui lui valut un Razzie Award), le remake du film de science-fiction de Norman Jewison, et Brian De Palma qui lui confie le rôle principal du thriller Femme fatale, celui de Laure Ash, une jeune femme ténébreuse et vénale aux multiples identités.
Enfin, après avoir donné la réplique à Robert De Niro dans le thriller fantastique Godsend, expérience interdite, elle replonge dans l'Univers des Marvel comics avec The Punisher de Jonathan Hensleigh, puis avec X-Men 2 en 2002 et X-Men : L'Affrontement final en 2006 où elle retrouve son personnage de Mystique. En 2010, l'actrice Jennifer Lawrence reprendra le rôle dans le film X-Men : Le Commencement.
Elle tient le rôle principal dans Pepper Dennis, une série télévisée sur The WB. La série ne rencontre néanmoins pas la succès et est annulée après une saison
Elle a joué dans la série américaine Ugly Betty le rôle d'Alexis Meade, la sœur transexuelle du rédacteur en chef du magazine Mode, Daniel Meade, et présidente de Meade Publications. Elle a joué également dans la série Carpoolers, avec son époux Jerry O'Connell (saison 1, épisode 5).