Neil Patrick Harris a commencé sa carrière d'acteur alors qu'il était encore enfant. Il joue son premier rôle significatif en 1988 dans le film Le secret de Clara (Clara's Heart), un drame avec Whoopi Goldberg qui lui vaut une pré-sélection aux Golden Globes, puis dans Purple People Eater en 1988.
L'année suivante, il décroche le premier rôle dans la série Docteur Doogie, pour lequel il est de nouveau nommé aux Golden Globes. Après la quatrième et dernière saison de la série, il incarne des seconds rôles dans plusieurs séries télévisées, avant d'incarner en 1995 son premier rôle principal en tant qu'adulte, dans le film de science-fiction Animal Room. Par la suite, il incarne de nombreux seconds rôles, comme dans Starship Troopers, Un couple presque parfait, Undercover Brother - Un agent très secret et Harold & Kumar chassent le burger ainsi que dans la suite de ce film, Harold et Kumar s'évadent de Guantanamo dans lequel il joue un drogué, parodie lubrique de lui-même.
De 1999 à 2000, il est la vedette, avec Tony Shalhoub, de la série Stark Raving Mad durant vingt-deux épisodes. Il incarne également des premiers rôles dans de nombreux téléfilms aux États-Unis et dans quelques séries.
Harris a également joué à Broadway dans plusieurs comédies musicales : en 2001, il joue le rôle de Tobias Ragg dans la comédie musicale Sweeney Todd. En 2002, il joue dans la pièce de théâtre La Preuve aux côtés d'Anne Heche à Broadway. En 2003, il joue le rôle d'Emcee dans Cabaret avec Deborah Gibson et Tom Bosley. En 2004, il joue le double rôle du Balladeer et de Lee Harvey Oswald dans la comédie musicale Assassins de Stephen Sondheim. Il a aussi chanté le rôle de Charles sur le disque La primevère du soir (The evening primrose), de Sondheim.
Depuis 2005, il incarne Barney Stinson dans la série télévisée How I Met Your Mother.
Le 7 mars 2010, lors de la 82e cérémonie des Oscars, il introduit la cérémonie avec un show chantant et dansant. La même année, il prête sa voix à Peter Parker / Spiderman dans le jeu vidéo Spider-Man : Shattered Dimensions, prestation pour laquelle il est récompensé lors des Video Games Awards 2010 par le prix du meilleur doublage masculin.
En 2010, il a également participé à l'épisode 19 de la saison 1 de Glee où il chante Dream On d'Aerosmith en duo avec Matthew Morrison. En 2011, il interprète le personnage de Patrick Winslow dans Les Schtroumpfs.
Le 15 septembre 2011, il obtient son étoile sur le prestigieux Walk of Fame d'Hollywood Boulevard à Los Angeles.